免疫組化輔助試劑包（兩步法）
使用說明書
僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!
第1版（2016年04月修訂）
[產(chǎn)品信息]
通過辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（抗抗體）與結(jié)合在組織片上的一抗特異性結(jié)合形成免疫復(fù)合物。位于聚合物上HRP會催化底物H2O2與DAB反應(yīng)，最終形成棕褐色不溶性色原，特異性的將免疫原在組織和細(xì)胞中標(biāo)定出來，通過顯微鏡觀察確定免疫原的最終位點。
[試劑組分]
編號 | 成分 | |||||
| 1 | 內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑工作液 | 3mL | 6mL | 18mL | 55mL | 110mL |
| 2 | HRP標(biāo)記抗IgG聚合物（可選） | 3mL | 6mL | 18mL | 55mL | 110mL |
| 3 | 封閉血清工作液 | 3mL | 6mL | 18mL | 55mL | 110mL |
| 4 | 蘇木素染液 | 3mL | 6mL | 18mL | 55mL | 110mL |
| 5 | 枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液(20×) | 10mL | 20mL | 60mL | 200mL | 400mL |
| 6 | 顯色劑 (1×) | 3mL | 6mL | 18mL | 55mL | 110mL |
| 7 | DAB顯色液 (50×) | 60uL | 120uL | 360uL | 1.1mL | 2.2mL |
[備選指標(biāo)]
編號 | 名稱 | 編號 | 名稱 |
IS085-1 | HRP標(biāo)記兔抗人IgG聚合物 | IS085-9 | HRP標(biāo)記兔抗犬IgG聚合物 |
IS085-2 | HRP標(biāo)記兔抗小鼠IgG聚合物 | IS085-10 | HRP標(biāo)記兔抗綿羊IgG聚合物 |
IS085-3 | HRP標(biāo)記兔抗大鼠IgG聚合物 | IS085-11 | HRP標(biāo)記兔抗貓IgG聚合物 |
IS085-4 | HRP標(biāo)記兔抗雞IgG聚合物 | IS085-12 | HRP標(biāo)記兔抗馬IgG聚合物 |
IS085-5 | HRP標(biāo)記兔抗豬IgG聚合物 | IS085-13 | HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG聚合物 |
IS085-6 | HRP標(biāo)記兔抗牛IgG聚合物 | IS085-14 | HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG聚合物 |
IS085-7 | HRP標(biāo)記兔抗山羊IgG聚合物 | IS085-15 | HRP標(biāo)記豚鼠抗兔IgG聚合物 |
IS085-8 | HRP標(biāo)記兔抗豚鼠IgG聚合物 |
[適用范圍]
本產(chǎn)品僅用于免疫組化實驗，適用于手工和機(jī)器大批量操作。本試劑僅對10%中性緩沖福爾馬林固定石蠟包埋的組織進(jìn)行了驗證，不作其他用途。
[儲存及有效期]
2～8℃避光保存，不得凍存；產(chǎn)品有效期為6個月。
[實驗操作]
1、完成IHC實驗還要的設(shè)備和試劑
a)、移液器、恒溫箱、修復(fù)儀、免疫組化筆、計時器、孵育盒、染色架、蓋玻片、光學(xué)顯微鏡、洗瓶。
b)、DAB顯色液：利用顯色劑稀釋DAB顯色液到工作液濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。
c)、pH 6.0，0.01M枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液：利用雙蒸水稀釋到工作液濃度使用。
2、實驗步驟
（1）烘片：鉛筆標(biāo)記用于區(qū)分石蠟切片，65℃，1-2h。
（2）脫蠟至水：烘片結(jié)束，石蠟切片依次于二甲苯I 30min，二甲苯II 30min，100%、100%、95%、80%、70%的乙醇中各10min，再放入純水里10min。
（3）抗原修復(fù)。高溫高壓法和微波法自選。
高溫高壓法：壓力鍋中加入pH 6.0 ，0.01M枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液約1000ml，切片插入塑料架上，放入壓力鍋，蓋上鍋蓋（此時不扣上壓力閥）1600W預(yù)熱至沸騰，扣上壓力閥1300W，待高壓鍋閥門噴氣開始計時，修復(fù)時間為2分鐘。
微波法：取一定量pH 6.0 ，0.01M枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液，加入微波盒中，微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，微波低火處理3分鐘，放置8分鐘后低火3分鐘，取出微波盒流水自然泠卻，從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS沖洗3分鐘×3次。
（4）阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。加入適量的內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10分鐘；PBS緩沖液沖洗3分鐘×3次。
（5）非特異性位點的封閉：甩去殘夜，滴加封閉血清工作液覆蓋切片，約200ul/片，室溫孵育20min。
（6）滴加一抗。根據(jù)組織大小，滴加100μL或適量的一抗，37℃孵育60分鐘；PBS緩沖液沖洗3分鐘×3次。
（7）根據(jù)實驗物種的差異選擇合適的HRP標(biāo)記抗IgG聚合物，滴加100μL或適量的HRP標(biāo)記抗IgG聚合物，37℃孵育30分鐘；PBS緩沖液沖洗3分鐘×3次。
（8）顯色。加入適量新鮮配制的DAB，室溫孵育30秒-5分鐘，根據(jù)顯微鏡下著色情況終止反應(yīng)。
（9）復(fù)染。自來水沖洗，蘇木素染色液孵育2分鐘；滴加1%鹽酸酒精分色1秒、PBS沖洗返藍(lán)。
（10）脫水、透明、封片。
（11）顯微鏡觀察，拍照。
[注意事項]
1、在每一次染色過程中，必須有空白對照和陰性對照實驗同時進(jìn)行。
2、如果陽性組織對照不能顯示適當(dāng)?shù)年栃匀旧?，?yīng)判定該批次樣本的檢測結(jié)果無效。
3、若HRP標(biāo)記IgG聚合物孵育溫度過高或孵育時間過長，可能導(dǎo)致染色過強(qiáng)及背景染色。
4、紅細(xì)胞和細(xì)胞色素 C可能會造成假陽性結(jié)果。
5、脫蠟不徹底，容易影響染色效果，建議免疫組化切片脫蠟與常規(guī)HE脫蠟分開。
6、為防止可能出現(xiàn)的假陽性、假陰性結(jié)果，在實驗過程中需設(shè)置陽性與陰性對照。
7、實驗中滴加試劑時，過多的PBS緩沖液會導(dǎo)致試劑被稀釋，將引起染色強(qiáng)度變?nèi)?，因此，滴加試劑前?yīng)除去多余的緩沖液。
8、在實驗操作過程中，請穿戴好手套、眼鏡和實驗服，以及依照相應(yīng)的實驗流程，做好防護(hù)措施。
