一氧化氮測定試劑盒 (A012)
使用說明書
僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!
第1版（2016年04月修訂）
[預(yù)期應(yīng)用]
本試劑盒運用硝酸還原法定量測定血清、胃液、尿液、細胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中一氧化氮（NO）含量。
[試劑盒內(nèi)容]
| 試劑名稱 | 數(shù)量（50/25T） | 試劑名稱 | 數(shù)量（50/25T） |
Reagent 1 | 2×6ml/1×6ml | Reagent 6 | 1/1 |
Reagent 2 | 2×6ml/1×6ml | Reagent 7 | 1×8mL//1×4ml |
Reagent 3 | 1×12ml//1×6ml | Standard(10mmol/L | 1×0.5ml/1×0.5ml |
Reagent 4 | 1×6ml//1×3ml | Attachment | 2×40ml/1×40ml |
Reagent 5 | 1/1 | Instruction manual | 1/1 |
Note：Attachment 是雙蒸水.
[需自備的設(shè)備及試劑]
1、分光光度計（比色測定波長為550nm），0.5厘米光路玻璃試管
2、恒溫水浴箱或恒溫箱（孵育溫度：37℃和90～100℃）
3、臺式離心機
4、微量移液器及吸頭
5、漩渦混合儀 ，玻璃棒
6、蒸餾水或去離子水
[試劑盒的儲存及有效期]
1、試劑1：-20℃或低于-20℃可保存3個月。使用前將試劑置于37℃或室溫下充分溶解。
2、試劑2：-20℃或低于-20℃可保存3個月。使用前將試劑置于37℃或室溫下充分溶解。
3、試劑3：室溫保存6個月。
4、試劑4：室溫保存6個月。
5、試劑5：避光保存。
6、試劑6：避光冷藏保存。如果顏色變成深褐色，則不能使用。
7、試劑7：室溫保存6個月。
8、10mmol/L標準：-20℃或低于-20℃可保存6個月。
[試劑準備]
1、混合試劑制備：混合試劑1和試劑2的比例為1:1，根據(jù)實驗需求量配置。完全混合后，需在24小時內(nèi)使用。
2、試劑5：粉末×1瓶，使用時，加入20ml（50T）或10ml×（25T）90OC~100℃熱蒸餾水完全溶解后，避光儲存。試劑5為過飽和溶液，最好加入23ml（50T）/11.5ml（25T）熱蒸餾水（考慮熱膨脹），同時水浴加熱，并用玻璃棒攪拌，使其完全溶解。配好的試劑5存放時可能會出現(xiàn)晶體，使用前請加熱并攪拌，使其完全溶解。
3、試劑6：粉末×1瓶，使用時加入8ml（50T）或4ml（25T）雙蒸餾水溶解。避光冷藏。如果顏色變成深褐色，請不要使用。
4。顯色劑：根據(jù)實驗需求量配置（配置好的顯色劑，可在1個月內(nèi)使用）。試劑5、試劑6和試劑7的混合比例為2.5:1:1?？纱娣旁?0ml干凈的方形瓶中，避光。低溫存放可能會出現(xiàn)晶體。再次使用時，100℃水浴加熱，反復(fù)搖動使其完全溶解。
5。100μmol/L標準工作液配制：取0.1ml標準品，加入雙蒸餾水，直至體積達到10ml（100倍稀釋），充分混合，濃度為100μmol/L標準工作液。準備后需立即使用。
[標本處理]
1、液體樣品（如血清、胃液、尿液、細胞培養(yǎng)上清和其他生物液體等）NO測定：
預(yù)處理：根據(jù)實驗方法。
2、組織樣品NO測定
預(yù)處理：根據(jù)實驗方法。
[操作步驟]
1、液體樣品NO測定
操作表：
空白 | 標準品 | 樣本 | |
雙蒸水 (ml | 0.1 | ||
100μmol/L 標準品工作液 (ml) | 0.1 | ||
液體樣本 (ml) | 0.1 | ||
混合試劑 (ml) | 0.4 | 0.4 | 0.4 |
| 充分攪拌，在37℃水浴中孵育60分鐘。 | |||
試劑 3 (ml) | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
試劑 4 (ml) | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
| 用漩渦混合儀充分攪拌30秒鐘，放置40分鐘，3500～4000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液進行顯色反應(yīng)。 | |||
上清 (ml) | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| ? 顯色液(ml | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
| 充分攪拌，放置10分鐘，吸取反應(yīng)液于比色皿（0.5cm)中，在550nm下測量OD值（用蒸餾水調(diào)零）。 | |||
說明：
a、如果在冬天完成試驗，請在37℃預(yù)熱所有試劑5分鐘。
b、如果上清液不足，請延長離心時間或減少上清取樣量（例如0.4ml或0.45ml），確保所有試管上樣體積一致，試管中不要有沉淀物。
2、組織樣品NO測定
操作表：
空白 | 標準品 | 樣本 | |
雙蒸水 (ml | 0.5 | 0.4 | |
100μmol/L 標準品工作液 (ml) | 0.1 | ||
勻漿 (ml) | 0.5 | ||
混合試劑 (ml) | 0.4 | 0.4 | 0.4 |
| 充分攪拌，在37℃水浴中孵育60分鐘。 | |||
試劑 3 (ml) | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
試劑 4 (ml) | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
| 用漩渦混合儀充分攪拌30秒鐘，放置40分鐘，3500～4000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液進行顯色反應(yīng)。 | |||
上清 (ml) | 0.8 | 0.8 | 0.8 |
| ? 顯色液(ml | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
| 充分攪拌，放置10分鐘，吸取反應(yīng)液于比色皿（0.5cm)中，在550nm下測量OD值（用蒸餾水調(diào)零）。 | |||
說明：
a、如果在冬天完成試驗，請在37℃預(yù)熱所有試劑5分鐘。
b、如果上清液不足，請延長離心時間或減少上清取樣量（例如0.4ml或0.45ml），確保所有試管上樣體積一致，試管中不要有沉淀物。
[實驗原理]
NO化學(xué)性質(zhì)非常活潑，易轉(zhuǎn)化為硝酸鹽（NO3-）和亞硝酸鹽（NO2-），NO2-也可轉(zhuǎn)化為NO3-。本試劑盒采用硝酸還原酶特異地將NO3-還原成NO2-，通過測定OD值計算NO含量。
[樣本值]
1、推薦采樣量：
牛血清：300μL
綿羊血清：300μL
大鼠和小鼠血清：100μL
兔血清：100μL
10%組織勻漿：500μl
細胞裂解液：500μL
細胞培養(yǎng)上清液：100μL
2、正常NO含量：
樣本 | 樣本量（僅供參考） | NO含量（僅供參考） |
大鼠血清 | 100μl | 38.0±23.4μmol/L |
小鼠血清 | 100μl | 49.96±23.76μmol/L |
兔血清 | 100μl | 99.16±39.5μmol/ |
狗血清 | 100μl | 89.51±32.13μmol/L |
[說明]
1、試劑1、試劑2和標準需避免反復(fù)凍融。如果要分次實驗（＞3次），那么請將試劑1、試劑2和標準分裝儲存，根據(jù)每次實驗的使用量分裝及配置試劑。制備好的顯色劑需避光。
2、樣本不立即用于實驗（如血清、血漿、組織等），可置于-70℃或低于-70℃保存。凍存樣品可在半年內(nèi)使用。
3、所有試劑配制和空白管需使用不含NO2-的雙蒸水或三蒸水（試劑盒有雙蒸餾水）。
4、完成反應(yīng)和離心后，取上清時避免吸入沉積物，否則OD值會大幅度增高，嚴重干擾結(jié)果的有效性。
5、試管選擇：
a、建議使用一次性塑料試管。
b、若要使用玻璃試管，請將其浸泡在洗滌劑溶液中超過半小時，煮沸0.5～1小時，小心刷洗，用自來水沖洗15～20次，棄水，用蒸餾水沖洗1～2次，烘干后使用。
